Hei og velkommen på labkurset i BIO104 - Komparativ fysiologi.
I dag skal du utføre Diauxi forsøk med den gram negative bakterien Vibrio natriegens.
Diauxi forsøket brukes til å fremføre den tofasede
veksten av bakterien med bruk av to forskjellige karbonkilder. I dagens forsøk så skal vi bruke glukose og rhamnose
som karbonkilder. Tofaseveksten forklares på denne måten. Først forbruker bakterien glukose som karbonkilde for å vokse.
Så langt glukose finnes i mediet, kan bakteriene multiplisere seg, men når glukose konsentrasjonen er lav så minker veksten.
Da begynner bakterien å forbruke rhamnose som er den alternative karbonkilden.
Dermed starter den andre vekstfasen. Merk at bakterien trenger å uttrykke nye gener før den kan bruke rhamnose.
Derfor tar det litt tid før den andre fasen begynner.
Her skal du utføre dette eksperimentet hvor du skal følge veksten av bakterien ved å måle cellekonsentrasjonen i kulturmediet.
Til dette formålet skal du bruke et spektrofotometer og en kyvette som inneholder løsningen med bakteriecellene.
Spektrofotometeret måler absorbansen i løsningen,
ifølge Beer-Lamberts lov er absorbansen proporsjonal med løsningens konsentrasjonen c og med lengden av lysveien l.
I tillegg bruker formelen den molare absorpsjonskoeffisienten epsilon som er spesifikk for det absorberende stoffet og som varierer med bølgelengden.
For å måle konsentrasjonen i løsningen skal du først ta en kyvette som kun inneholder mediet inn i spektrofotometeret.
Lukk lokket og pass på at bølgelengden er satt på 600 nanometer og at målingen viser 0,000.
Hvis ikke må du nullstille maskinen. Deretter tar du en kyvette med bakterieløsningen og leser av absorbansen.
Nå setter vi i gang eksperimentet. 150 mL kulturmedium forvarmes i en flaske plassert i vannbadet.
Sett sammen en glasspipette, en slange og en akveriepumpe og bruk det til å blåse luftbobler i løsningen.
Nå kan du tilsette 1 mL startkultur inn i flasken.
Bland forsiktig. Ta litt av løsningen i en kyvette
og mål absorbansen. Den skal være cirka 0,3.
Tilsett glukose og rhamnose. Noter verdien og tiden. Dette blir T0.
Fra nå av skal du måle absorbansen etter 20 minutt, og deretter skal du måle hvert tiende minutt.
Alle målingene føres i en tabell som for eksempel i Excel eller en noe lignende.
Det er best om dataen står i to kolonner, den ene med tid og den andre med absorbans.
Når dette er gjort, kan du lage en graf. Velg dataene.
Trykk på Insert, Insert Line or Area Chart og velg det første alternativet.
Her får du en graf som viser veksten. Høyreklikk på grafen og velg Select Data...
I denne menyen, under Horizontal Axis Label
trykk på Edit og velg tidspunktene i kolonnen Tid.
Trykk to ganger på OK. Nå har du en graf som viser veksten som en funksjon av tiden.
Mer info om kosten i bruke Excel finner du på biostats (biostats.w.uib.no).
Lykke til med forsøket og rapporten.